Technische rekombinante DNA, Anwendungen und Grundlagen

Er Rekombinante DNA (DNA oder rDNA) ist ein im Labor erzeugter künstlicher Nukleinsäuremolekül durch Integration von zwei interessierenden Organismussegmenten. Dank seiner hybriden Eigenschaft ist es auch als chimäre DNA bekannt. Wir finden diese Art von DNA in der Natur nicht.

Die grundlegende Methodik zur Erzeugung umfasst: (a) die Auswahl einer weißen DNA und ihre Insertion in ein anderes DNA -Fragment (im Allgemeinen ein bakterielles Plasmid); (b) die Einführung dieses Plasmids in einem Bakterium, (c) die Selektion von Bakterien durch Antibiotika und schließlich (d) die Expression des Gens.

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Die Technik nutzt ein Enzymspiel, mit dem Sie bestimmte DNA -Fragmente kopieren und in den Versuch des Forschers einfügen können.

Das Ziel der rekombinanten Technologie ist in den meisten Fällen die Expression eines Proteins (bekannt als rekombinantes Protein), das vom molekularen Biologen für zukünftige Untersuchungen gewünscht oder ein Protein aus kommerziellem und therapeutischem Wert erzeugt wird - wie zum Beispiel ein menschliches Insulin -.

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Grundlagen der rekombinanten DNA -Technik und ihrer Verwendung in der Gentechnik

Das zentrale Dogma der molekularen Biologie

Alle organischen Wesen, von denen wir wissen, dass sie mehrere Merkmale teilen. Einer von ihnen ist die Natur des genetischen Materials und die Art und Weise, wie Proteine ​​produziert werden - Prozess, der als zentrales "Dogma" der Molekularbiologie bekannt ist.

Mit Ausnahme eines Virenpaares speichern alle Organismen genetische Informationen in DNA (Desoxyribonukleinsäure), die sehr kompakt und im Zellkern organisiert sind.

Für die Genexpression wird das DNA -Molekül in die Messenger -RNA transkribiert und letzteres in Aminosäuresprache übersetzt, die Strukturblöcke von Proteinen.

Was ist eine rekombinante DNA?

Zwischen den 70ern und 80ern begannen molekulare Biologen, die Prozesse zu nutzen, die natürlich in der Zelle auftreten, und gelang es, sie auf das Labor zu extrapolieren.

Auf diese Weise konnte ein tierisches Gen (z. B. ein Wirbeltier) in ein DNA -Segment aus einer Bakterien eingeführt werden; oder die DNA eines Bakteriums könnte mit einer viralen DNA kombiniert werden. Somit können wir eine rekombinante DNA als ein Molekül definieren, das aus DNA aus zwei verschiedenen Organismen besteht.

Sobald dieses Hybrid- oder rekombinantes Molekül erstellt wurde, gehen wir mit der Expression des Interessesgens fort. Mit dem Wort Ausdruck Wir möchten uns auf den Protein -Translationsprozess beziehen.

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Beschränkung und Ligen Enzyme: Der Schlüssel zum Prozess

Ein Schlüsselelement zur Entwicklung der rekombinanten DNA -Technologie war die Entdeckung von Restriktionsenzymen.

Dies sind Proteinmoleküle, die die Fähigkeit aufweisen, sich in Betonsequenzen in DNA (NuLeas) aufzuteilen, die als "molekulare Schere" dienen, die dienen, die dienen. Die von diesen Enzymen erzeugten Fragmente werden als Restriktionsfragmente bezeichnet.

Diese Enzyme können in den weißen Sequenz symmetrischen Schnitten (in beiden Ketten in derselben Höhe) oder asymmetrischen Schnitten produzieren. Ein wesentlicher Aspekt der Wirkung von Restriktionsenzymen ist, dass nach der Aufteilung der Ketten eine "lose Kante" erhalten wird, ergänzt zum anderen Rand, der durch das gleiche Enzym geschnitten wird.

Einige Beispiele sind ECOR 1 und SMA 1. Derzeit sind mehr als 200 Arten von Einschränkungsenzymen bekannt und sie sind im Handel erhältlich.

Um nützlich zu sein, muss eine Schere vom Kleber begleitet werden. Diese DNA -Dichtungswirkung (zuvor mit Restriktionsenzymen behandelt) wird von Ligen durchgeführt.

Technik: Wie ist die DNA eines Organismus im Labor künstlich verändert??

Als nächstes werden wir die Hauptschritte beschreiben, die durch rekombinante DNA -Technologie erforderlich sind. Alle werden von Fachleuten in einem Molekularbiologie -Labor durchgeführt.

Was ist ein "Klon"?

Bevor wir das experimentelle Protokoll fortsetzen, müssen wir feststellen, dass in der molekularen Biologie und Biotechnologie der Begriff "Klon" und das Verb "Clonar" weit verbreitet sind. Dies könnte zu Verwirrung führen.

In diesem Zusammenhang beziehen wir uns nicht auf das Klonen von alle Ein Organismus (wie im Fall der berühmten Dolly -Schafe), aber zum Klonen eines DNA -Fragments, das ein Gen sein kann. Das heißt, produzieren viele Kopien - genetisch identisch - der Sequenz.

1. Isolierung und DNA erhalten

Der erste Schritt besteht darin, zu entscheiden, welche Sequenz verwendet werden möchte. Dies hängt völlig vom Forscher und den Zielen seiner Arbeit ab. Dann muss diese DNA isoliert und gereinigt werden. Die Methoden und Verfahren, um dies zu erreichen, hängen vom Organismus und dem Gewebe ab.

Ein Teil des Gewebes wird im Allgemeinen eingenommen und wird in einem Lyse -Buff behandelt. Anschließend wird die Fragmentierung von genetischem Material in kleinen Fragmenten fortgesetzt.

2. Klonvektor

Nach den vorbereitenden Schritten versucht der Forscher, das Interesse des DNA -Segments für einen Klonvektor einzuführen. Von nun an werden wir es weiße DNA nennen.

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Plasmide

Eines der am häufigsten verwendeten Vektoren in einem Plasmid bakterieller Herkunft. Ein Plasmid ist ein doppeltes kindliches DNA -Molekül, das wir in Bakterien auf natürliche Weise finden. Sie sind Entitäten außerhalb des bakteriellen Chromosoms - das heißt, sie sind extrakromosomal und sind natürlich in diesen Prokaryoten enthalten.

Die Grundelemente eines Vektors sind: (a) ein Ursprung der Replikation, die die DNA -Synthese ermöglicht; (b) Selektionsmittel, das es ermöglicht, Organismen zu identifizieren, die das Plasmid mit weißer DNA tragen, z. B. Resistenz gegen ein Antibiotikum; und (c) Multiclonationsstelle, an denen die Sequenzen, die durch Restriktionsenzyme erkannt werden, gefunden werden.

Die erste erfolgreiche rekombinante DNA im Labor wurde im PSC101 -Plasmid aus den Bakterien kloniert UND. coli. Dies enthält eine Restriktionsstelle für das ECORI -Restriktionsenzym und ein Resistenzgen gegen ein Antibiotikum zusätzlich zum Ursprung der Replikation.

Die Einführung der weißen DNA im Plasmid erfolgt unter Verwendung der molekularen Werkzeuge von Restriktionsenzymen und Ligen, die im vorherigen Abschnitt beschrieben wurden.

Substanzielle Arten von Vektoren

Zusätzlich zu den Plasmiden kann die DNA in einen anderen Vektor eingeführt werden, wie z. B. das Lambda -Bakteriophagen.

3. Einführung der rekombinanten DNA

Sobald das rekombinante DNA -Molekül (Gen des Interesses am Plasmid oder eines anderen Vektors) erhalten wurde.

Um fremde DNA in ein Bakterium einzuführen, wird eine Technik bezeichnet, die als bakterielle Transformation bezeichnet wird, wobei der Körper einer Behandlung mit zweiwertigen Kationen unterzogen wird, die es anfällig für DNA -Einnahme macht.

Methodisch können wir nicht sicherstellen, dass 100% der Bakterien in unserer Ernte unser rekombinantes DNA -Molekül gewonnen haben. Hier kommt der Teil des Plasmids, der Antibiotikaresistenz enthält.

Somit wird Bakterien, die das Plasmid eingenommen haben, gegen ein bestimmtes Antibiotikum resistent sein. Um sie auszuwählen, reicht es für die Anwendung des Antibiotikums aus und nimmt die Überlebenden ein.

4. Protein "Ernte"

Nachdem wir Bakterien mit unserer rekombinanten DNA ausgewählt haben. Wenn Bakterien reproduziert werden, geht das Plasmid zu seinen Nachkommen, so dass es während der Teilung nicht verloren geht.

Dieses Verfahren verwendet Bakterien als eine Art „Fabrik“ von Protein. Später werden wir sehen, dass es ein sehr relevantes Verfahren bei der Entwicklung wirksamer medizinischer Behandlungen war.

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Sobald die Ernte fertig ist und die Bakterien große Mengen an Proteinen erzeugt haben, ist die Zelle oder das Bruch der Zelle. Es gibt eine Vielzahl von biochemischen Techniken, die die Proteinreinigung entsprechend ihren physikalischen chemischen Eigenschaften ermöglichen.

In einem anderen experimentellen Kontext sind wir vielleicht nicht daran interessiert, Protein zu erzeugen, aber wir sind daran interessiert, die DNA -Sequenz zu erhalten an sich. Wenn dies der Fall wäre, würde das Plasmid für die Erstellung mehrerer Kopien des Fragments dienen, das uns mit dem Ziel interessiert.

Anwendungen

Die rekombinante DNA -Technologie eröffnete eine unendliche Anzahl von Möglichkeiten für molekulare Biologie, Biotechnologie, Medizin und andere verwandte Bereiche. Ihre herausragendsten Anwendungen sind die folgenden.

Genetische Analyse

Die erste Anwendung steht in direktem Zusammenhang mit molekularen Biologie -Laboratorien. Die rekombinante DNA -Technologie ermöglicht es den Forschern, die normale Funktion von Genen zu verstehen, und erzeugte Proteine ​​können in der nachfolgenden Forschung verwendet werden.

Pharmaindustrie

Proteine, die unter Verwendung des rekombinanten DNA -Verfahrens produziert werden, haben Anwendungen in der Medizin. Zwei sehr relevante Beispiele auf dem Gebiet sind menschliches Insulin und Wachstumshormon, die bei Patienten, denen ein solches Protein fehlt, angewendet wird.

Dank der rekombinanten DNA können diese Proteine ​​erzeugt werden, ohne dass es aus einem anderen Menschen extrahieren muss, was zusätzliche methodische Komplikationen und Gesundheitsrisiken darstellt. Dies hat dazu beigetragen, die Lebensqualität unzähliger Patienten zu verbessern.

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