DAPI (4 ', 6-Diamidino-2-fenylindol) Eigenschaften, Grundlage, Verwendung

Er DAPI (4 ', 6-Diamidino-2-Phenylindol) Es handelt. Die Fluoreszenz, die es emittiert, ist hellblau, seine Aufregung tritt zwischen 455 und 461 nm (UV-Licht) auf.

Der DAPI -Farbstoff kann die Zellmembran mit großer Leichtigkeit aus toten Zellen überqueren. Sie können auch lebende Zellkerne färben, aber in diesem Fall muss die Konzentration davon größer sein.

Chemische Struktur der Fluoreszenzdyst. Quelle: Bild: Datei: DAPI.SVG ist eine Vektorversion dieser Datei. Es sollte anstelle dieses Rasterbildes verwendet werden, wenn nicht unteren/Richard Wheeler (Zephyris) [CC BY-SA 3.0 (http: // creativecommons.Org/lizenzen/by-sa/3.0/)] bearbeitetes Bild

Der Farbstoff ist in der Lage, auf die Zell -DNA zugreifen zu können, durch die er eine besondere Affinität hat, und verbindet sich mit großer Avidität mit den Adenin- und Thymin -Stickstoffbasen. Aus diesem Grund ist es in einigen Techniken der molekularen Biologie sehr nützlich.

Diese Verbindung gehört zur Gruppe der indolischen Farbstoffe und hat gezeigt, dass sie eine größere Empfindlichkeit gegenüber DNA aufweist als das Ethidium -Bromid und das propidische Jodid, insbesondere gegen Agarosegele.

Die Verwendung dieses fluoreszierenden Farbstoffs ist sehr breit, da er nützlich ist, um: Untersuchung von Veränderungen in der DNA in apoptotischen Prozessen (Zelltod) und damit Zellen in diesem Prozess nachweisen; Für DNA -Fußabdruckfoto (fotografischer Druck von DNA); Bakterienkontamination zu untersuchen; o Um die Kernsegmentierung zu visualisieren.

Es wurde auch in der Untersuchung von chromosomalen Banden zum Nachweis von DNA von verwendet Mycoplasmas sp, In der DNA-Protein-Wechselwirkung, bei der Färbung und Zählung von Zellen durch Immunfluoreszenz und sogar färbende reife Pollenkörner.

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Eigenschaften

DAPI ist die Abkürzung seines chemischen Namens (4 ', 6-Diamidino-2-Phenylindol). Seine molekulare Formel ist c₁₆H_fünfzehnN_5. Es hat ein Molekulargewicht von 350,3. In der Nähe des UV-Lichtbereichs (345 bis 358 nm) tritt die maximale Anregung des DAPI-ADN-Komplexes auf, während die maximale Fluoreszenzemission zwischen 455 und 461 nm erfolgt.

Dieser Farbstoff ist gekennzeichnet durch ein gelber Staub, aber die mit diesem Fluorophor gekennzeichneten Strukturen emittieren ein hellblaues Licht.

Es ist jedoch eine wasserlösliche Verbindung, um ihre Auflösung zu beschleunigen. Eine gewisse Wärme kann jedoch angewendet werden. Es kann mit PBS verdünnt werden, sich jedoch nicht direkt in diese auflösen.

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Sobald der Farbstoff vorbereitet wurde, muss er in der Dunkelheit gespeichert werden, dh vor Licht geschützt, bei einer Temperatur von 2 bis 8 ° C (Kühlschrank). Unter diesen Bedingungen ist der Farbstoff mehr als 3 Wochen oder Monate stabil.

Wenn das Licht geschützt ist, aber seine Stabilität bei Raumtemperatur auf 2 oder 3 Wochen bleibt, aber dem direkten Licht ausgesetzt ist, ist die Verschlechterung sehr schnell. Wenn Sie viel länger sparen möchten, können Sie bei -20 ° C in Aliquots kühlen.

Basis

Diese Färbung basiert auf der Erzeugung einer Kerneinstellung in den Haupttechniken der molekularen Biologie, wie z.

Diese Technik basiert auf der großen Affinität, die der Farbstoff für die stickstoffhaltigen Basen (Adenin und Timin) hat, die im genetischen Material (DNA) in der kleinen Rille enthalten sind. Während auf der zytoplasmatischen Ebene verlässt sehr wenig Boden.

Wenn die Vereinigung des fluoreszierenden Farbstoffs zu den Regionen von Adenin und Timina von DNA auftritt, nimmt die Fluoreszenz signifikant zu (20 -mal mehr). Die Farbe, die sie emittiert, ist hellblau. Es ist zu beachten, dass bei der Bindung an GC-Basenpaare (Guanina-Citosin) keine Fluoreszenzemission vorliegt, dass es keine Fluoreszenz-Emission gibt.

Es ist wichtig hervorzuheben, dass es zwar auch eine Affinität zu RNA hat, es jedoch kein Problem verursacht, da der größere Energieemission dieses Molekül. Zusätzlich beträgt die Zunahme der Fluoreszenz, sobald sie mit RNA verbunden sind.

Der DAPI wird mehr verwendet, um tote (fixe) Zellen zu färben, die Sie leben, da die Zellmembran für den DAPI, wenn sie lebt, eine viel höhere Konzentration des Farbstoffs benötigt wird, um zu färben.

Der DAPI -Farbstoff kann in Kombination mit roten und grünen Fluorophoren verwendet werden, um eine mehrfarbige Erfahrung zu erhalten.

Verwenden

Das DAPI (4 ', 6-Diamidino-2-Phenylindol) ist ein ausgezeichnetes Fluorophor und wird daher in verschiedenen Techniken und für verschiedene Zwecke häufig verwendet. Die Verwendung von DAPI wird unten in den Haupttechniken erläutert.

Durchflusszytometrie

Die Forscher Gohde, Schumann und Zante im Jahr 1978 waren die ersten, die das DAPI als Fluorophor in der Durchflusszytometrie -Technik verwendeten und vorgeschlagen haben, was aufgrund ihrer hohen Empfindlichkeit durch DNA und ihrer hohen Intensität bei der Emission von Fluoreszenz großer Erfolg hatte.

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Die Verwendung von DAPI in dieser Technik ermöglicht die Untersuchung des Zellzyklus, die Quantifizierung von Zellen und die Färbung von lebenden und toten Zellen.

Obwohl es andere Farbstoffe wie Ethidiumbromid, Hoechstoxid, Acridinorange und Propidio -Jodid gibt.

Für diese Technik ist es notwendig. Die Probe ist zentrifugiert und der Überstand wird verurteilt.

Während die Zeit den DAPI -Farbstoff mit einem Färbungspuffer (Foxp3 von Biolegend) auf 3 uM verläuft.

Zentrifug der Probe, den Überstand verwerfen und dann 15 Minuten bei Raumtemperatur mit 1 ml DAPI -Lösung abdecken.

Nehmen Sie die Probe mit dem rechten Laser zum Durchflusszytometer.

Durchflussmikrofluorometrie

Eine andere Technik, bei der das DAPI verwendet wird. Beide sind nützlich zur Quantifizierung.

Hybridisierung Vor Ort 

Diese Technik verwendet im Grunde genommen DNA -Sonden, die mit einem fluoreszierenden Farbstoff gekennzeichnet sind, der das DAPI sein kann.

Die Probe muss mit Wärme behandelt werden, um die DNA der beiden Klassen zu denaturalisieren und sie in zwei monocypenäre Ketten zu verwandeln. Anschließend wird es mit einer mit DAPI gekennzeichneten DNA -DNA -Sonde hybridisiert, die eine Sequenz von Interesse hat.

Anschließend wird es gewaschen, um das zu beseitigen, was nicht Hibrid war. Ein Kontrast wird verwendet, um die DNA zu visualisieren. Das Fluoreszenzmikroskop ermöglicht die Beobachtung der hybridisierten Sonde.

Diese Technik soll spezifische Sequenzen in chromosomaler DNA nachweisen und bestimmte Krankheiten diagnostizieren können.

Diese Cito-molekularen Techniken waren hilfreich, um Details in der Untersuchung der Karyotypen zu bestimmen. Zum Beispiel hat es die Regionen in Paaren von Adenosin- und Thyminbasen beweist, die als heterochromatische Regionen oder DAPI -Banden bezeichnet werden.

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Diese Technik wird häufig für die Untersuchung von Chromosomen und Chromatin in Pflanzen und Tieren sowie für die Diagnose pränataler und hämatologischer Pathologien beim Menschen verwendet.

In dieser Technik beträgt die empfohlene DAPI -Konzentration 150 ng/ml für eine Zeit von 15 Minuten.

Die bereits montierten Objektträger sollten bei 2-8 ° C vor Licht geschützt werden.

Färbung der Immunfluoreszenz

Die Zellen sind mit 4% Paraformaldehyd fixiert. Wenn andere Farbstoffe verwendet werden, bleibt DAPI am Ende als Einstellung und die Zellen mit PBS -Lösung für 15 Minuten bedeckt. Während die Zeit vergeht, bereiten Sie die DAPI -Lösung vor, die mit PBS verdünnt wird, damit die Endkonzentration 300 µm beträgt.

Dann wird der überschüssige PBS extrahiert und 5 Minuten lang mit DAPI bedeckt. Mehrmals waschen. Das Blatt wird in einem Fluoreszenzmikroskop unter dem richtigen Filter beobachtet.

Sicherheitsblatt

Diese Verbindung muss sorgfältig manipuliert werden, da es sich um eine Verbindung handelt, die mutagene Eigenschaften aufweist. Aktivkohlenstoff wird verwendet, um diese Verbindung von wässrigen Lösungen zu beseitigen, die verworfen werden.

Handschuhe, Roben und Sicherheitslinsen sollten verwendet werden, um Unfälle bei diesem Reagenz zu vermeiden. Wenn Kontakt oder Schleimkontakt auftritt, sollten Sie den Bereich mit genügend Wasser waschen.

Sie sollten niemals über dieses Reagenz mit Ihrem Mund putzen und Propipets verwenden.

Kontaminieren Sie das Reagenz mit mikrobiellen Mitteln nicht, da dies zu fehlerhaften Ergebnissen führt.

Den DAPI -Farbstoff nicht mehr als empfohlen verdünnen, da die Qualität der Färbung erheblich abnimmt.

Stellen Sie das Reagenz nicht dem direkten Licht aus oder halten Sie Wärme nicht, da es die Fluoreszenz verringert.

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