Foundation -Elektrophorese, Technik, wofür es, Beispiele

Der Elektrophorese Es ist eine Technik, mit der Moleküle in einem elektrischen Feld trennen. Dies muss insbesondere mit der Migration von Partikeln unter dem Einfluss eines elektrischen Stroms zwischen zwei Polen, einem positiv und einem negativ.

Die Elektrophorese ist derzeit eines der routinemäßigsten Verfahren, die während der Entwicklung eines Experiments stattfinden, insbesondere in Bereichen im Zusammenhang mit analytischer Chemie, Biochemie sowie biologischen und medizinischen Wissenschaften im Allgemeinen.

Elektrophorese -Eimer. Quelle: Melodargar/CC BY-SA (https: // creativecommons.Org/lizenzen/by-sa/4.0)

Es wird verwendet, um Protein, Peptide, DNA, RNA und andere entsprechend ihrer Last, Größe, Dichte und Reinheit zu trennen.

Die verschiedenen Handelshäuser haben unterschiedliche Formate mit unterschiedlichen Anwendungen und geeigneten Gewinnen für bestimmte Zwecke entworfen. Alle Verfahren erfordern jedoch die gleichen Grundelemente:

- Eine Energiequelle, um elektrische Ladung zu erzeugen

- Ein Medium der Unterstützung für die Trennung

- Eine Pufferlösung (Puffer) Um den pH konstant zu halten

[TOC]

Basis

Elektrophorese ist nichts anderes als die Migration (Trennung) von Partikeln oder belasteten Molekülen (natürlich oder künstlich) in einem Medium oder Stütze unter dem Einfluss eines elektrischen Feldes.

Die Technik basiert auf einer der wichtigsten physikalischen Gleichungen des Elektromagnetismus, wonach die Kraft gleich der elektrischen Ladung multipliziert mit dem an diesem Punkt angelegten elektrischen Feld (F (Kraft) = q (elektrische Ladung) x E (elektrisches Feld ).

Nach dieser Gleichung bewegen sich zwei Partikel mit gleicher Masse, aber unterschiedlicher Last, zu unterschiedlichen Raten im selben elektrischen Feld. Darüber hinaus hängt die Bewegungsgeschwindigkeit dieser Partikel von der Beziehung zwischen ihrer Last und ihrer Masse ab.

Wissenschaftler haben diese Eigenschaften und Fracht-/Massenbeziehungen ausgenutzt, um die Komponenten von Biomolekülen in ihren kleinsten Teilen zu trennen und verschiedene Moleküle in einer Mischung zu trennen, unter anderem Anwendungen.

Es ist wichtig zu bedenken.

Technik

Obwohl es verschiedene Arten von Elektrophorese gibt, ist die Gelelektrophorese am häufigsten in der biochemischen Analyse, der molekularen Biologie und der Biotechnologie verwendet.

Wie der Name schon sagt, impliziert Gelelektrophorese die Verwendung eines festen festen Stützmedium.

Das System oder die Apparat, die zur Durchführung eines elektrophoretischen „Laufs“ verwendet werden, kann horizontal (normalerweise für Nukleinsäuren verwendet) oder vertikal (normalerweise für Protein verwendet) sein).

- Beispiel für die Nukleinsäurelektrophorese -Technik

Nukleinsäuren werden normalerweise unter Verwendung von Agarosegelen (Galactose -Polysaccharid) getrennt, die mit einer ausreichenden Pufferlösung (Tris/Acetat/EDTA oder Tris/Borato/EDTA) hergestellt werden und deren Konzentration die "Auflösung" von Fragmenten von Differenzgrößen bestimmt.

Kann Ihnen dienen: Erdnahrungskette der Erde: Glieder und Beispiele

Probenvorbereitung

Der erste Schritt vor der Durchführung eines elektrophoretischen Laufs in einem Agarosegel besteht darin, die Probe zu erhalten. Dies hängt vom experimentellen Ende ab und die Proben können das Produkt einer enzymatischen Verdauung sein, auf einer Polymerasekettenreaktion (PCR), einer Reinigung von Nukleinsäuren usw.

Mischen Sie die Probe mit dem Lastbuff.Org/lizenzen/bis/4.0) über Wikimedia Commons)

Nach dem Erhalten wird dies mit einer farbigen Lösung (Lastlösung) gemischt, die die schnelle Ablagerung der Probe in einem Brunnen ermöglicht, da es Glycerin und einen Farbstoff hat, der den Lauf visuell ermöglicht.

Gelvorbereitung

Dieser Schritt besteht darin, die notwendige Menge des Gelell -Substrats (Agarose) mit der Pufferlösung zu mischen, es mit Wärme zu schmelzen und es auf einer Stütze zu verfestigen, die als "Schimmel" fungiert.

Während der Gelegenheit werden einige "Kämme" in das in der "Form" positionierte Gel eingeführt, um die "Brunnen", in denen die Proben vor dem Lauf eingeführt werden, abzugrenzen.

Sobald das Gel abgekühlt und verfestigt ist, werden die "Kämme" entfernt und in einen Behälter bekannt gegeben, der als "Bucket" bekannt ist, der voller laufender Pufferlösung ist (Tris/Acetat/EDTA oder Tris/Borato/Borato/EDTA).

Dieser Eimer ist wiederum in einer sogenannten „elektrophoretischen Kammer“ enthalten, die nichts weiter als den Behälter ist, durch den das elektrische Feld übergeben wird und der einen Raum hat, in dem das Gel eingeführt wird, und zwei Abschnitte, mit denen sie gefüllt sind Pufferlösung (Puffer laufen).

Diese Kamera verfügt über zwei Elektroden, eine positive und ein Negativ, unter der die Ionenbewegung nach der Anwendung eines elektrischen Feldes erzeugt wird (sie ist an eine Stromquelle angeschlossen).

Proben laden

Sobald die Proben sich mit der jeweiligen Lastlösung gemischt haben, werden diese in die zuvor in das Gel verwandelten "Brunnen" eingeführt.

Da Nukleinsäuren eine negative Nettobelastung aufweisen, migrieren sie vom negativen Pol zum Positiv. Daher muss dies berücksichtigt werden wo die Proben geladen wurden.

Corrida -Zeit wird in strikter Abhängigkeit von dem Forscher für das Experiment festgelegt. Die Spannung wird im Allgemeinen in einem Zentimeter von 5 Volt pro Zentimeter im Gel berechnet, das die beiden Elektroden trennt.

Anzeige

Wenn das Gel läuft (wenn die Proben das Gel von einem Ende zum anderen bewegt haben), wird es in eine Lösung von Ethid Bromid (ETBR) eingetaucht Sie können in einem Transsilumenant unter Verwendung von ultraviolettem Licht sichtbar gemacht werden.

Was ist Elektrophorese für?

Elektrophorese wurde historisch gesehen mit mehreren Zwecken verwendet. Heute hängt seine Nützlichkeit jedoch weitgehend von der „Frage“ ab, dass dem Forscher in Bezug auf ein Phänomen oder ein bestimmtes System sowie die Art der Elektrophorese, die er verwenden möchte.

Kann Ihnen dienen: topoisomerase: Was sind, Eigenschaften, Funktionen, Typen

Wir können jedoch einige der Hauptfunktionen, die diese Technik hat, mit den "seltensten" und endet von den beliebtesten und größtenteils ausgebeuteten in der Welt der biologischen Wissenschaften einbeziehen. Elektrophorese ist nützlich:

- Für die quantitative Analyse komplexer Gemische von Makromolekülen und zur Berechnung des potenziellen "Zeta" (kolloidale Eigenschaft eines Partikels in einem flüssigen Medium unter Einfluss eines statischen elektrischen Feldes).

- Zur Analyse von Blutseren für diagnostische Zwecke.

- Zur Trennung von Glucoproteinen, Lipoproteinen und Bluthämoglobin.

- Für die Lebensmittelanalyse, pharmazeutische Produkte und Umweltschadstoffe.

Elektrophorese in Agarosegelen

- Zur Trennung von DNA -Fragmenten nach Verdauung mit Restriktionsenzymen.

- Zur Trennung von Nukleinsäuremolekülen vor dem Übertragen auf Membranen für nachfolgende Analysen.

- Für die Analyse von PCR -Produkten (Polymerasekettenreaktion) überprüfen Sie, ob sie aufgetreten sind oder nicht.

- Für die Schätzung der Größe der Moleküle in einer Mischung aus DNA oder RNA.

- Zur Abschätzung der Menge und/oder der Qualität von gereinigten Nukleinsäuren.

Elektrophorese in Polyacrylamidgelen unter denaturalisierenden oder nativen Bedingungen

- Um die Größe eines Proteins zu bestimmen.

- Proteine ​​identifizieren.

- Um die Reinheit einer Probe nach mehreren Reinigungsschritten zu bestimmen.

- Um das Vorhandensein von intramolekularen Disulfidverbindungen zu identifizieren.

- Um die Wechselwirkung zwischen Proteinen zu bestimmen.

- Um den isoelektrischen Punkt eines Proteins zu bestimmen.

Fotografie eines Acrylamidgels nach dem Lauf mehrerer Proteinproben (Quelle: Larionova.Marina/CC BY-SA (https: // creativecommons.Org/lizenzen/by-sa/4.0) über Wikimedia Commons)

Faktoren, die die Elektrophorese beeinflussen

Die Migration eines Teilchens in einem elektrischen Feld hängt von verschiedenen Faktoren ab, darunter:

- Ihre elektrische Ladung

- Seine molekulare Größe

- Seine Hydrophobizität und seine Form

- Die Größe des angelegten elektrischen Feldes

- Die Systemtemperatur und die Ionenkraft der verwendeten Pufferlösung

- Die Art der Umgebung, in der sie sich befindet

In Bezug auf die Stichprobe

Unter den Parametern, die sich auf Partikel (Probe) beziehen, die einem elektrischen Feld ausgesetzt sind, haben die Hauptfaktoren, die diesen Prozess beeinflussen, mit ihrer Last, ihrer Größe und Form zu tun.

Je größer die Nettobelastung eines Teilchens ist, desto größer ist seine Migrationsrate und diese Größe hängt vom pH -Wert ab. Die Beziehung zur Größe ist jedoch umgekehrt proportional, was bedeutet, dass je "das" große "das Molekül mehr" ist, desto langsamer wandert.

Es kann Ihnen dienen: Lia Agar (Eisenlysin): Was ist, Fundament, Vorbereitung, verwendet

In Bezug auf das elektrische Feld

Bisher haben wir über die Bedeutung des elektrischen Feldes gesprochen, um die Bewegung eines Partikels durch Elektrophorese zu erreichen, aber wir haben nicht definiert, was es ist: Elektrische Kraft pro Lasteinheit oder in einfacherem Hinsicht einen Bereich des Raums, in dem es gibt eine elektrische Kraft.

Die Parameter bezüglich des elektrischen Feldes, die die Migration beeinflussen können, sind Spannung, Strom und Widerstand.

Die Spannung beeinflusst die „Flugzeit“ der Moleküle, die nach dem Auftragen des elektrischen Feldes getrennt sind. Je höher es ist, desto schneller bewegen sich diese.

Der Strom (kontinuierliche und gleichmäßige Elektronen, die von der Spannungsquelle „gedrückt“ werden) wird dank der in der Pufferlösung vorhandenen Ionen zwischen den elektrophoretischen Systemelektroden durchgeführt. Steht in direktem Zusammenhang mit der Spannung.

In Bezug auf die Pufferlösung

Die Zusammensetzung, die Ionenkraft und der pH -Wert der Pufferlösung sind die Hauptparameter, die einen elektrophoretischen "Lauf" beeinflussen, da sie einige der Eigenschaften der Proben, insbesondere die elektrische Ladung, direkt beeinflussen.

Weil? Die Pufferlösung stabilisiert den pH -Wert des Stützmediums, bei dem eine Elektrophorese auftritt. Seine Zusammensetzung kann die Verschiebung der Migrationspartikel und die ionische Konzentration auch beeinflussen, da sie direkt mit dem Strom zusammenhängt.

In Bezug auf das Unterstützungsmedium

Die verschiedenen Arten und Formate der Elektrophorese präsentieren auch verschiedene Medien, auf denen Migration auftritt und wo sie anschließend "registriert" werden kann, "registriert" werden kann.

Die Migrationsrate der einer Elektrophorese unterworfenen Molekülen hängt von der Art des Stützmediums ab, was normalerweise inert sein sollte.

Seine Absorptionsmerkmale, Elektroendo-Osmose sind wichtig (Bewegungskapazität einer Flüssigkeit durch eine Membran unter dem Einfluss eines elektrischen Feldes) und ihre molekulare Siebkapazität.

Beispiele für die Verwendung von Elektrophorese

Klassische Beispiele für elektrophoretische Techniken, die in Biologie und Biotechnologie verwendet werden, sind:

- Elektrophorese in Agarosegelen (Englisch Elektrophoresegel)

- Elektrophorese bei Acrylamidgelen bei denaturalisierenden Bedingungen (SDS-PAGE, Englisch Natriumdodecylsulfat Polyacrylamid -Gelelektrophorese)

- Elektrophorese bei Acrylamidgelen unter nativen Bedingungen (BN-PAGE, Englisch Blue Native Polyacrylamid -Gelelektrophorese)

- Elektrophorese in zwei Dimensionen (2D-Seite, aus Englisch Zweidimensionale Polyacrylamid-Gelelektrophorese)

- Kapillarelektrophorese (aus Englisch Elektrophorese Kapillare)

- Isolectroenfoque (Englisch Isolektrophokusion)

- Gepulste Feldelektrophorese (Englisch Gepulste Feldelektrophorese)

Verweise

1. Beck, Kevin. (2020, 25. Mai). Die Arten der Elektrophorese. Wissenschaftlich.com. Aus der Wissenschaft abgerufen.com
2. Essays, Großbritannien. (November 2018). Elektrophorese -Typen und Anwendungen. Abgerufen von Ukessays.com
3. Nelson, d. L., Lehninger, a. L., & Cox, m. M. (2008). Lehninger Prinzipien der Biochemie. Macmillan.
4. Parmar, p. (August 2018). Elektrophorese: Bedeutung, Definition und Klassifizierung (mit Diagramm). Biokechnologie. Abgerufen von Biotechnologie.com
5. Perrett, d. (2010). 200 Jahre Elektrophorese. Chromatog. Heute 4-7.
6. Righetti, p. G. (2005). Elektrophorese: Der Marsch von Pennies, der Marsch von Dimes. Journal of Chromatography A, 1079 (1-2), 24-40.
7. Rilbe, h. (1995). Einige Erinnerungen an die Geschichte der Elektrophorese. Elektrophorese, 16 (1), 1354-1359.
8. Vesterberg, oder. (1993). Eine kurze Geschichte elektrophoretischer Methoden. Elektrophorese, 14 (1), 1243-1249.
9. Vinayagam, m. (Kein Datum). Faktoren, die die Elektrophorese beeinflussen. Akademie.Edu. Aus der Akademie abgerufen.Edu