Immunfluoreszenzstiftung, Protokoll und Anwendungen

Der Immunfluoreszenz Es ist eine leistungsstarke Immunomarcy -Technik, die Antikörper verwendet.

Diese mikroskopische Beobachtung dieser Technik mit Immunspezifität ermöglicht die Beobachtung von lebenden oder toten Zellen, die winzige Mengen an Antigenen aufweisen können. Es wird sowohl im Forschungsgebiet als auch in der klinischen Diagnose verschiedener Pathologien weit verbreitet.

Immunomarität von Aktinfilamenten in Kardiomyozytenzellen (Quelle: PS1415 [CC BY-SA 4.0 (https: // creativecommons.Org/lizenzen/by-sa/4.0)] über Wikimedia Commons)

Diese hauptsächlich qualitative Technik (mit einigen quantitativen Varianten) muss speziell mit der Visualisierung einer Probe durch das Produkt eines Fluorophors, einem fluoreszierenden Molekül, das an einen Antikörper gebunden ist und das in der Lage ist, sich an einer bestimmten Wellenlänge zu spenden, darstellt.

Im Zellkontext ist es sehr nützlich, das Vorhandensein/Fehlen und die subzelluläre Position von Proteinen zu untersuchen. Die Technik wurde in ihren Anfängen im klinischen Bereich zur Diagnose von Viren wie Influenza und anschließend für viele andere Infektionskrankheiten verwendet.

Es ist eine Technik der großen Empfindlichkeit und mit dem richtigen Mikroskopie -Team kann es eine sehr gute Auflösung haben. Es erfordert für seine Beobachtung die Verwendung konfokaler oder Epifluoreszenzmikroskope.

Obwohl Sie jedoch sehr beliebt sind, können Sie einige wichtige Probleme bei der Erlangung einer unspezifischen Fluoreszenz aufweisen, die ein bestimmtes "Rauschen" im Hintergrund erzeugt, was häufig die ordnungsgemäße Lektüre der Ergebnisse einschränkt.

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Basis

Immunfluoreszenz basiert auf der Ausbeutung des biologischen Phänomens der Wechselwirkungsreaktion zwischen einem Antikörper und einem Antigen. Es muss sich speziell mit der Visualisierung oder dem Nachweis dieser Reaktion auswirken, wenn sie fluoreszierende Moleküle bei einer bestimmten Wellenlänge anregen.

Ein Antikörper ist ein aus aktiver B -Zellen abgesondertes Immunglobulinprotein und wird spezifisch gegen ein Antigen erzeugt, das mit großer Affinität und Spezifität verbunden werden kann. Immunfluoreszenz verwendet IgG -Immunglobuline, die im Blutserum löslich empfunden werden.

Die Antikörper sind Moleküle bis zu 950 kDa aus zwei kurzen Peptid (Licht) und zwei Längen in Form von "Y" (schwer). Sowohl leichte als auch schwere Ketten sind in zwei Domänen unterteilt: eine Variable, die das Antigen erkennen kann, und eine andere Konstante oder erhaltene, charakteristisch für jede Art.

Antigene werden funktional als Moleküle definiert, die von einem Antikörper erkannt werden können und hauptsächlich Proteine ​​sind. Wenn ein Tier einem Antigen ausgesetzt ist, werden Lymphozyten des Immunsystems aktiviert, wodurch spezifische Antikörper gegen sie produziert werden und als Verteidigungssystem funktionieren.

Ein Antigen, wie zum Beispiel ein Protein, kann mehr als ein Epitop oder Ort der Erkennung für einen Antikörper haben, sodass das Serum des Tieres, das einem Antigen ausgesetzt ist.

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Immunfluoreszenz nutzt dann die Fähigkeit eines Tieres aus, polyklonale Antikörper gegen ein bestimmtes Antigen zu produzieren, um es zu reinigen und später zum Nachweis desselben Antigens in anderen Kontexten zu verwenden.

Unter den am häufigsten verwendeten Fluoreszenzfarbstoffen oder Molekülen für einige Immunfluoreszenztechniken sind Fluorescein-Isootiocyanat (FITC), Tetramethylrodamin-5 und 6 (Tritc) Isochianat, viele Cyanine wie Cy2, Cy5 und Cy5 und Cy7 und Dyes genannt, wie Alexa Fluor®, wie die Alexa-Fluor®, wie Alexa, die Alexa, die Alexa (Alexa), wie Alexa, die Alexa, die Alexa, die Alexa, die Alexa, die Alexa, die Alexa, die Alexa, die Alexa, die Alexa, die Alexa, die Alexa, die Alexa, die Alexa, die Alexa, die Alexa, die Alexa, die Alexa, die Alexa, wie die Alexa, wie die Alexa Fluor®448.

Protokoll

Das Immunfluoreszenzprotokoll variiert abhängig von vielen Faktoren, und im Allgemeinen umfasst jedoch eine lineare Sequenz von Schritten, die bestehen aus:

• Herstellung von Blättern und Zellen
• Probenfixierung
• Permeabilisierung
• Blockierung
• Immunotiv oder immunomarcaje
• Montage und Beobachtung

-Vorbereitung

Der Proben

Die Vorbereitung der Proben hängt von ihrer Natur und der Art der Erfahrung ab, die erledigt werden muss. Als nächstes wird der einfachste Fall erklärt, was die Verwendung von suspendierten Zellen impliziert.

Suspensionszellen, dh in einem flüssigen Kulturmedium müssen zuerst durch Zentrifugation getrennt werden und dann mit einer Pufferlösung oder „gewaschen werden“ oder „Puffer" isosmotisch, was seine Integrität bewahrt.

Normalerweise wird ein Phosphat-Salinpuffer als PBS bekannt, bei dem die Zellen resuspendiert werden.

Der Blätter

Die für die mikroskopischen Beobachtung verwendeten Blätter, wobei die Zellen für die entsprechenden nachgeschalteten Behandlungen festgelegt werden, müssen ebenfalls sorgfältig vorbereitet werden.

Diese werden mit einer Polysinlösung bedeckt oder "sensibilisiert" Zellen.

Probenfixierung

Dieser Prozess besteht darin, die Proteine, die sich im zellulären Innenraum befinden, zu immobilisieren, um ihren räumlichen Ort intakt zu halten. Die verwendeten Moleküle sollten in der Lage sein, alle Arten von Zellmembranen zu überqueren und Rahmen mit kovalenten Proteinen zu bilden.

Der Formaldehyd und Paraformaldehyd, Glutaraldehyd und sogar Methanol werden häufig verwendet, mit denen Zellproben für eine bestimmte Zeit inkubiert werden und sie dann mit einer isosmotischen Pufferlösung waschen.

Nach der Fixierung der Zellen schließt es sich ihnen weiterhin mit den zuvor sensibilisierten Blättern mit Polysin zusammen.

Permeabilisierung

Abhängig von der Art des durchgeführten Tests muss die untersuchten Zellen permeabilisiert werden oder nicht, oder nicht die untersuchten Zellen. Wenn das gesucht wird, ist die Permeabilisierung eines bestimmten Proteins auf der Zelloberfläche nicht erforderlich.

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Wenn Sie dagegen die Position eines Proteins im zellulären Innenraum wissen möchten, ist die Permeabilisierung unverzichtbar und besteht darin, Proben mit Triton X-100 zu inkubieren.

Blockierung

Ein grundlegender Schritt in allen immunologischen Techniken ist die Blockierung. In dieser Phase des Verfahrens besteht die Blockade aus der Abdeckung in den sensibilisierten Blättern an allen Stellen mit Polyesinmolekülen, an denen die Zellen nicht eingehalten wurden. Das heißt, es verhindert jede unspezifische Gewerkschaft.

Normalerweise werden Lösungen mit Albumin von Molke Rinder (BSA) in PBS -Puffer verwendet, und die besten Ergebnisse werden erzielt, je länger die Inkubationszeit mit dieser Lösung ist. Nach jedem Schritt, einschließlich der Blockade, müssen die verbleibende Lösung durch Waschen entfernen.

Immunotiv oder immunomarcaje

Das Immunomarität oder die Immunomaritätsverfahren hängen hauptsächlich bei einer direkten oder indirekten Immunfluoreszenz ab (siehe später).

Wenn es sich um eine primäre oder direkte Immunfluoreszenz handelt, werden die Proben mit den gewünschten Antikörpern inkubiert, die mit fluoreszierenden Farbstoffen gekoppelt werden müssen. Das Inkubationsverfahren besteht aus einer Verdünnung des Antikörpers in einer Lösung, die BSA ebenfalls enthalten wird, aber in einem geringeren Verhältnis.

Wenn der Fall der einer sekundären oder indirekten Immunfluoreszenz ist, müssen zwei aufeinanderfolgende Inkubationen gemacht werden. Zuerst mit den gewünschten Antikörpern und dann mit den Antikörpern, die die konstanten Regionen primärer Immunglobuline nachweisen können. Es sind diese sekundären Antikörper, die kovalent für Fluorophore vereint sind.

Die Technik ist sehr vielseitig und ermöglicht gleichzeitige Markierungen von mehr als einem Antigen pro Probe, solange sie im Fall von direkter Immunfluoreszenz primäre Antikörper haben, die mit verschiedenen Fluorophoren gekoppelt sind.

Für gleichzeitige Markierungen im indirekten Immunfluoreszenz ist es notwendig.

Wie die Blockade liefert die Inkubation mit Antikörpern bessere Ergebnisse, je größer die Zeit davon ist. Nach jedem Schritt ist es notwendig, die überschüssigen Antikörper zu waschen, die sich nicht den Proben angeschlossen haben.

Bestimmte Techniken verwenden andere Farbstoffe, die nichts mit Immunzie zu tun haben, wie z.

Montage und Beobachtung

Während der endgültigen Inkubationszeit mit Fluorophoren ist es notwendig, dass die Proben im Dunkeln bleiben. Für die Mikroskopbeobachtung ist es häufig.

Leute

Grafische Zusammenfassung der direkten und indirekten Immunfluoreszenz (Quelle: WestHayl618 [CC BY-SA 4.0 (https: // creativecommons.Org/lizenzen/by-sa/4.0)] über Wikimedia Commons)

Direkte oder primäre Immunfluoreszenz

Es hat mit dem Nachweis von Antigenen durch die Verwendung von fluoreszierenden Antikörpern zu tun. Der Hauptvorteil der Verwendung dieser Technik ist die Geschwindigkeit, aber viele Fälle von unspezifischer Vereinigung können dabei auftreten, insbesondere bei der Untersuchung menschlicher Seren, da sie reich an sehr heterogenen Antikörpern sind.

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Indirekte oder sekundäre Immunfluoreszenz

Es ist auch als „Sandwich“ -Technik bekannt, und dies impliziert die Entwicklung der Technik in zwei Schritten. Das erste hat mit der Verwendung eines nicht -fluoreszierenden Antikörpers und seiner Vereinigung gegen das Interessesantigen zu tun.

Gegen die konstante Region dieses ersten Antikörpers (der nun als Antigen dienen wird) ein zweiter Antikörper, der erkennen kann, wird mit einem fluoreszierenden Molekül verbunden.

Das Auftreten eines fluoreszierenden Signals ist das Ergebnis der spezifischen Erkennung zwischen dem ersten nicht -fluoreszierenden Antikörper und dem interessierenden Antigen; Das Vorhandensein dieses ersten Antikörperzustand.

Obwohl diese Technik eine Technik ist, die viel länger als die direkte Immunfluoreszenz (da sie einen Inkubationsschritt enthält), bedeutet diese Technik nicht das Design eines fluoreszierenden Antikörpers für jedes untersuchte Antigen, das sich in wirtschaftlichen Begriffen entspricht, lebensfähiger, lebensfähiger.

Darüber hinaus ist es eine empfindlichere Technik in Bezug.

Anwendungen

Wie bereits erwähnt, ist Immunfluoreszenz eine äußerst vielseitige Technik, an die die Vielzahl von Verwendungszwecken in den wissenschaftlichen und klinischen Bereichen gegeben wurde. Es kann verwendet werden, um ökologische, genetische und physiologische Fragen zu vielen Organismen zu beantworten.

Unter den klinischen Anwendungen wird es zur direkten Diagnose einiger dermatologischer Erkrankungen verwendet, unabhängig davon.

Immunfluoreszenztechniken wurden in einzelligen Organismen wie Hefen angeordnet, um intranukleäre und zytoplasmatische Mikrotubuli, Actin und assoziierte Proteine, 10 nm -Filamente und andere Bestandteile des Cytoplasmas, der Membran und der Zellwände zu visualisieren.

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