Halb Löwenstein-Jensen Foundation, Vorbereitung und Verwendung

Er Middle Löwenstein-Jensen Es ist ein selektives festes Medium für die Isolierung und Entwicklung von Bakterien der Gattung Mycobacterium, wie z Mycobacterium tuberculosis, M. Avium, unter anderem mit Ausnahme der Leprae -Arten, die nicht kultivierbar sind.

Bakterien der Gattung Mycobacterium wachsen nicht in konventionellen Kulturmedien, daher war es notwendig, ein besonderes Mittel für seine Isolation zu entwerfen. Das ursprüngliche Medium wurde von Löwenstein erstellt und dann von Jensen modifiziert.

Halb Löwenstein-Jensen mit Kolonien von Mycobacterium tuberculosis. Quelle: Agarwal et al. / Biomed Central Ltd., Mit freundlicher Genehmigung der Biologie -Bildbibliothek

Die Modifikation bestand aus der Eliminierung des rot. Es veränderte auch die Konzentrationen von Magnesiumcitrat und monopotasischem Phosphat.

Das Löwenstein-Lose-Medium enthält derzeit Papatstärke, Asparragin, Magnetic Citrat, Monopophasenphosphat, Magnetsulfat, Malachitgrün, Nalidíxiko-Säure, Cycloheximid.

Mykobakterien wird normalerweise von Standorten isoliert, die nicht steril sind, wie Sputum, Urin, Abszesse unter anderem. Dies bedeutet, dass die meisten Proben die übliche Mikrobiota des Gebiets sowie den Erreger enthalten.

Deshalb enthält das Medium Löwenstein-Jensen eine Reihe von Inhibitoren in seiner Zusammensetzung, die durch Malachitgrün, Antibiotika und Antimykotika dargestellt wird.

Darüber hinaus müssen Proben, die von nicht sterilem Standort stammen.

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Basis

Das Vorhandensein von Ei und Glycerin im Löwenstein-Jensen-Medium stimuliert das Wachstum von Mykobakterien, da sie Fettsäuren und Proteine ​​liefern, die für die Entwicklung dieser Mikroorganismen erforderlich sind.

Das Löwenstein-Jensen-Medium enthält Malachitgrün, ein begleitender Mikrobiota-Inhibitor. Es enthält aber auch Nalidíxic -Säure (35 µg/ml), die die gramnegativen Mikrobiota, Cycloheximid (400 µg/ml) hemmt.

Einige Handelshäuser ziehen es vor, die folgende Kombination von Antibiotika hinzuzufügen: Polymixina b 200.000 Einheiten/l, Amphotericin B 10 mg/l, Carbenicillin 50 mg/l und Trimetoprima 10 mg/l.

Dieses Medium enthält keinen Agar, daher erfolgt die Verfestigung des Mediums durch die Koagulation des im Eiers vorhandenen Albumin während der Sterilisation.

Vorbereitung

Wiegen Sie 37,3 g des dehydrierten Mediums in 600 ml destilliertem Wasser, das zuvor 12 ml Glycerin zugegeben wurde. Die Mischung wird erhitzt und häufig bis zu ihrer Gesamtauflösung rührt. Autoklavar das Medium bei 121 ° C für 15 Minuten.

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Andererseits sollte eine homogene Suspension von 1000 ml frischer Eier unter aseptischen Bedingungen hergestellt werden. Fügen Sie die Eiersuspension bei 600 ml hinzu, die bei einer Temperatur von 50 bis 60 ° C hergestellt werden, und vermeiden Sie Luftblasen.

Antibiotika -Lösungen werden nach der Sterilisation im Autoklav ebenfalls hinzugefügt.

Gießen Sie das Medium in sterilen Testrohre mit einem Gewindestopfen. Erhitzen Sie die Röhrchen bei 85 ° C 45 Minuten in geneigter Position.

Die Farbe des vorbereiteten Mediums ist Aguamaringrün und kann weißliche Punkte für das Vorhandensein von Eierlipiden aufweisen.

Der mittlere pH muss 7,2 ± 0,2 betragen

Speichern Sie die Kühlschrankrohre und schützt bis zur Verwendung vor direktem Licht. Becken Sie vor Aussaat.

Es gibt eine Modifikation des Mediums, das als "Gruppenmodifikation des Löwenstein Jensen" bezeichnet wird. Diese enthält die gleichen Verbindungen wie das klassische Medium, aber RNA-5 mg/100 ml wird zugesetzt, und als Inhibitoren enthält es Malachitgrün, 0,025 g/100 ml, Penicillin 50 U/ml und Nalidíxico 35 ug/ml Säure.

Anwendungen

Das Löwenstein-Jensen-Medium wird für die Mykobakterienisolierung aus verschiedenen Probenarten verwendet. Es wird empfohlen, eine Ziehl-Neelsen-Färbung für jede Probe durchzuführen, in der das Vorhandensein von Mykobakterien vermutet wird.

Einige Proben kommen aus sterilen Standorten, andere jedoch nicht. Nicht -sterile Proben müssen so dekontaminiert werden, wie der Fall sein mag:

Sputum

Sputum -Proben müssen wie folgt dekontaminiert werden: Bestimmen Sie die Menge der Sputumprobe in ML und ergänzen Sie die gleiche Menge von 4% NaOH und Incube auf 37 ° C.

Schütteln Sie die Mischung über einen Zeitraum von 30 Minuten häufig. Anschließend zentrifugue bei 3000 U / min 30 Minuten lang.

Verwerfen Sie den Überstand mit einer phenolischen Desinfektionslösung. Verwenden Sie das Säensediment, aber zuerst muss der pH -Wert neutralisiert werden.

Um das Sediment zu neutralisieren, wird H verwendet₂SW₄ bei 5% in Gegenwart des roten Phenolindikators, bis es zu einem neutralen pH -Wert führt, der eine Lachsfarbe entsteht.

Magenwäsche, Bronchialwäsche und Bronchialaspirat

In diesem Fall sollte die Stichprobe 30 Minuten bei 3000 U / min zentrifizieren. Der Überstand wird verworfen und das Sediment wird verwendet. Um das Sediment zu dekontaminieren, werden 3 ml 4% NaOH zugegeben und häufig für eine halbe Stunde bei 37 ° C gerührt.

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Zentrifuge wieder, der Überstand wird verworfen und das Sediment wird verwendet. Letzteres muss wie in der Sputumprobe erklärt werden.

Urin

Lassen Sie die Probe 24 Stunden im Kühlschrank. Den Überstand trennen. Das verbleibende Sediment muss 30 Minuten bei 3000 RMP zentrifugiert werden. Den Überstand wieder verwerfen und das Sediment mit 3 ml sterile physiologische Lösung wiederherstellen.

Fügen Sie 3 ml 4% NaOH hinzu und gehen Sie zur Dekontamination und Neutralisierung wie zuvor beschrieben.

Ascitische Flüssigkeit, Pleuraflüssigkeit, Cerebrospinalflüssigkeit

In dieser Art von Probe ist es zentrifugiert und der Überstand wird verworfen. Machen Sie ein Gramm zum Sediment oder beobachten Sie direkt im Mikroskop; Wenn Bakterien nicht beobachtet werden, ist der Durchgang der Dekontamination nicht erforderlich und auch die Neutralisation.

In diesem Fall kann die Probe direkt mit dem Sediment gesät werden. Wenn Bakterien vorhanden sind, dekontaminieren und neutralisieren Sie wie oben beschrieben.

Biopsien

Diese Art von Probe sollte 5 ml destilliertes Wasser zu einer späteren Zentrifuge bei 1500 U / min für 10 Minuten zugegeben werden. Verwerfen Sie den Überstand und zentrifugieren Sie das Sediment bei 3500 U / min 30 Minuten lang. Verwenden Sie das Sediment, um das Kulturmedium zu säen.

Hiophare Laryngeal

Der Tupfer muss in ein steriles Rohr eingeführt werden, das gleiche Teile destilliertes Wasser und 4% NaOH enthält. Der Tupfer muss auf die Wände des Rohrs gedrückt werden, so dass die Probe in der Flüssigkeit verdünnt wird. Zentrifuge und Sediment verwenden. Neutralisieren Sie das Sediment wie bereits beschrieben.

Gesät

Die Medien Löwenstein-Jensen werden durch Zugabe von 0,5 ml der Probe auf der Oberfläche des Mediums inokuliert. Drehen Sie das Rohr, um die Probe im gesamten Medium zu verteilen. Tragen Sie keinen Platingriff.

Sie können einen zweiten Röhrchen mit Halbstonebrink säen, um zu isolieren Mycobacterium bovis und andere Arten, die nicht in der Löwenstein-Jensen-Umgebung wachsen.

Inkubation

Inokulierte Röhrchen werden in Aerobiose bei 37 ° C mit leicht faulen Deckel inkubiert und bei ungefähr 5 ° geneigt und vor Licht geschützt. Die Umwelt mit Kohlendioxid kann mit 5-10% angereichert werden. Überprüfen Sie die Pflanzen zweimal pro Woche bis zum Erscheinen von Kolonien.

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Wenn die Probe absorbiert wurde, werden die Tapas eingestellt. Die maximale Inkubationszeit beträgt 8 Wochen, wenn nach dieser Zeit kein Wachstum als negativ angegeben wird.

QA

Als Qualitätskontrolle können Sie die folgenden Stämme verwenden:

Mycobacterium tuberculosis ATCC 27294,  Mycobacterium kansasii ATCC 12478, Mycobacterium avium ATCC 19291, Mycobacterium bovis ATCC 19219, Mycobacterium fordiguitum ATCC 6841, Escherichia coli ATCC 25922, Streptococcus pyogenes ATCC 19615, Cryptococcus Neoformans ATCC 32045

Für die ersten drei genannten Arten wird eine hervorragende Entwicklung erwartet, um M. Fordiguitum Wachstum muss gut sein, während für M. BOVIS Es wird knapp oder null Wachstum erwartet. Während andere Arten als die Gattung Mycobacterium vollständig gehemmt werden müssen.

Einschränkungen

Das vorbereitete Medium muss sich vor Licht schützen, längere Lichtbelastung macht das Medium Vire von grün nach blau, in diesem Fall kann das Medium nicht mehr verwendet werden. Dies liegt daran, dass Malachites Grün photosensitiv ist.

Das Medium, wie es Ei enthält, kann leicht kontaminiert werden, wenn es aseptisch nicht manipuliert wird. Es kann gelöst werden, wenn es mit proteolytischen Bakterien kontaminiert ist.

Die Kultivierung und Manipulation von Bakterien der Gattung Mycobacterium erfordert qualifiziert.

HCl sollte nicht im Durchgang der Neutralisation aufgrund der Bildung von Natriumchlorid verwendet werden, was für den Koch Bacillus toxisch sein kann.

Proben müssen gekühlt und vor Licht geschützt werden, solange sie nicht verarbeitet werden.

Referenz

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