Bradford -Methode Was ist Prinzip, Reagenzien, verwendet, verwendet

Er Bradford -Methode Es handelt sich um eine kolorimetrische Methode, die derzeit zur schnellen Schätzung der Gesamtproteinkonzentration in biologischen Experimentierproben verwendet wird. Es wird in zahlreichen Bereichen der biologischen, medizinischen, tierärztlichen, agronomischen Forschung usw. verwendet.

Es ist bekannt als "Bradford Method" Eine schnelle und empfindliche Methode zur Quantifizierung von Proteinen in Mengen von Mikrogramm unter Verwendung des Prinzips der Protein-Youth-Union.

Foto einer Elisa-Plakette, auf der Proben für eine Quantifizierung von Bradford vorbereitet sind (Quelle: Helito, CC BY-SA 4.0, über Wikimedia Commons)

Seit ihrem Vorschlag wurde diese Methode im Volksmund populär gemacht, da sie empfindlicher anerkannt ist als andere Proteinquantifizierungsmethoden (z. B. Lowry und Biuret); stabilere komplexere Form und ist wirtschaftlich und leicht auszuführen.

Darüber hinaus wurde gezeigt, dass die von ihnen verwendeten Reagenzien in spektrophotometrischen Messungen unter verschiedenen Bedingungen nur sehr geringe Interferenzen aufweisen.

[TOC]

Methodenprinzip

Bradfords Methode basiert auf der Quantifizierung von Farbveränderungen in einer Lösung aufgrund der Vereinigung - unter sauren Bedingungen - der Proteinmoleküle einer Probe mit den Molekülen eines speziellen Farbstoffs: Coomassie Blue Brilliantes Blau G250.

Wenn dieser Farbstoff einer Proteinlösung zugesetzt wird, bindet er durch elektrostatische Kräfte an diese Moleküle und diese Reaktion wird als rötlich -braune Farbänderung zu Blau zu Blau belegt.

Proteine ​​und Aminosäuren

So wie der Körper von vielen Zellen gebildet wird und Nukleinsäuren (wie DNA und RNA) durch Nukleotide gebildet werden, werden Proteine ​​durch geordnete Sequenzen einiger Moleküle gebildet, die als Aminosäuren bekannt sind.

Eine Aminosäure ist ein Molekül, das aus einem zentralen Kohlenstoffatom besteht.

Es gibt 20 Aminosäuren, die für alle Proteine ​​üblich sind, die sich in Bezug auf die Eigenschaften ihrer Seitengruppen voneinander unterscheiden: Es gibt grundlegende Aminosäuren, Säuren, Polar, apolar, zyklisch, aromatisch usw.

Kann Ihnen dienen: Shelfords Toleranzgesetz: Was ist und Beispiele und Beispiele

Die Summe der Eigenschaften dieser Aminosäuren und die Reihenfolge, in der sie sich der Proteinstruktur bilden.

Tint-Protein-Komplex

Bradfords Methode quantifiziert also das Vorhandensein von Aminosäureresten von Basismerkmalen in biologischen Proben, insbesondere Aminosäuren wie Arginin, Lysin und Histidin, die leichter mit Coomassie -Blau untergebracht sind.

Farbänderungen werden als Variationen der Absorption der Proben quantifiziert, die unter Verwendung eines auf eine Wellenlänge von 595 nm angepassten Spektrophotometers gemessen werden.

Was ist Absorption??

Es ist auch als optische Dichte bekannt und definiert die Lichtmenge, die von einer Lösung absorbiert wird. Diese Absorption hängt von der Wellenlänge des Lichts ab, das zur Bestrahlung der Lösung verwendet wird, da nicht alle Moleküle die gleiche Wellenlänge absorbieren können.

Dieses Phänomen wurde in einem Gesetz zusammengefasst.

Wenn beispielsweise ein Licht durch eine Lösung übertragen wird, gibt es zwei Intensitätsmessungen: eine einfallende Intensität (vor dem Überqueren der Lösung) und eine übertragene Intensität (im Allgemeinen niedriger, was dem Lichtanteil entspricht, der nicht von der Lösung absorbiert wurde).

Die Beziehung zwischen beiden Werten wird als Verarbeitung bezeichnet und hat Werte zwischen 0 und 1 oder wird prozentual ausgedrückt.

Die Absorption hängt mit der Verarbeitung des logarithmischen Weges zusammen, und das Bier-Lambert-Gesetz schlägt eine lineare Beziehung zwischen der Absorption einer Lösung und ihrer Konzentration, ihrem Koeffizienten der molaren Extinktion und dem optischen Koeffizienten der Lösung vor; Die mathematische Gleichung, die dieses Gesetz beschreibt, lautet wie folgt:

Kann Ihnen dienen: Schädliche Fauna: Ursachen der Proliferation, Konsequenzen, Kontrolle

A (Absorption) = ε (molarer Extinktionskoeffizient) C (Konzentration) l (Lichtspaltlänge)

Die Konzentration einer Lösung wird berechnet, indem das Unbekannte der Gleichung und die relevanten Berechnungen nicht bekannt ist (c = a/εl)

Was ist ein Spektrophotometer?

Es ist ein Gerät, das verwendet wird, um die Lichtmenge (abhängig von der Wellenlänge) zu quantifizieren, die die Moleküle in einer Lösung absorbiert.

Spektrophotometer arbeiten, indem ein Lichtstrahl (sichtbar oder ultraviolett) emittiert wird, das durch ein Prisma (oder ein Gerät bekannt als bekannt ist Beugungsnetzwerkmonochromator) Das zerbricht es in den verschiedenen Wellenlängen, die es ausmachen, und ermöglicht es, eine bestimmte Länge zu "auswählen".

This light is passed through a special tube that contains the sample that is analyzed and subsequently reaches a detector that perceives the amount of light that is transmitted from said sample (which was not absorbed) which can be observed later thanks to a "Interpreter" that hat eine grafische Schnittstelle.

Der Farbstoff: Coomassie Blue Brilliantes Blau G 250

Das wichtigste Reagenz dieser Methode ist ohne Zweifel der Farbstoff, mit dem die Proteine ​​in der Probe "markieren" werden können. Bradford schlug seinen Job vor, weil dieser Farbstoff auf zwei Arten existiert: ein Rot und ein Blau. Die rote Form wird zur blauen Form, sobald der Farbstoff an ein Protein bindet und einen Komplex bildet.

Der Blau-Protein-Blue-Komplex hat einen sehr hohen Molon-Extinktionskoeffizienten, was zu einer größeren Empfindlichkeit für die Quantifizierung der Proteinkonzentration in den analysierten Proben führt.

Reagenzien

Obwohl die für diese Quantifizierungsmethode verwendete Lösung im Allgemeinen in geschlossenen Behältern vermarktet wird, die bereits vorbereitet sind -die „Bradford Reactive“ -, sind die verwendeten Hauptreagenzien:

- Coomassie Blue Brilliantes Blau G50 (0.01% w/v)

- Phosphorsäure (8.5 % w/v)

- Ethanol (4.7% w/v)

Proteinquantifizierungskit nach Bradfords Methode (Quelle: Vivo Rolfe, CC BY-SA 4.0, über Wikimedia Commons)

Wie bei jeder Methode und jedem Proteinquantifizierungsprotokoll durch spektrophotometrische Methoden ist es erforderlich, ein "Standard" oder "Standard" -Protein zu haben, um eine durchzuführen Kalibrierungskurve die Absorptionswerte zu bestimmen, die sich auf verschiedene Proteinkonzentrationen beziehen; Im Allgemeinen wird Rinder -Serumalbumin verwendet.

Kann Sie dienen: Schokoladenagar

Die Methode besteht darin, bestimmte Bände der Proben zu mischen Problem mit bestimmten Bänden von Bradfords Reagenz; Warten Sie ein paar Minuten, bis die Wechselwirkung zwischen Farbstoff-Protein und Farbänderungen erkennbar und anschließend gemessen wird, und zeichnen Sie die Absorptionswerte auf, um nachfolgende Berechnungen durchzuführen.

Verwendet/Anwendungen

Bradfords Methode ist eine der Quantifizierungs- oder Schätzmethoden der am häufigsten verwendeten Proteinkonzentration der Welt, hauptsächlich aufgrund ihrer niedrigen Kosten, auf die Geschwindigkeit, mit der die Ergebnisse erhalten werden, bis zur großen Stabilität zwischen dem Protein und dem verwendeten Farbstoff zu seine Reproduzierbarkeit und die minimale Interferenz, die die Komponenten der während der Messung verwendeten Reagenzien haben.

Die Methode wird in Hunderten verschiedener wissenschaftlicher Anwendungen zur Bestimmung von Proteinen in verschiedenen Kontexten verwendet: physiologische, zytologische, immunologische, klinische, industrielle (insbesondere in der Lebensmittelindustrie) usw.

Experimentell ist diese Methode sehr nützlich für:

• Überwachen Sie die Menge an Protein, die in den Volumina enthalten ist, die progressiv aus einer chromatographischen Säule erhalten werden (in Affinitätsäulen, Ionenaustausch, Absorption, Gelfiltration) i) i.Und. Analyse der Brüche von Proteinreinigungsprotokollen.
• Überwachen Sie die Proteinmenge, die in einem Gel für die Elektrophorese geladen ist.
• Schätzen Sie die Menge an Protein, die in einem Überexpressionssystem erhalten wurde.

Verweise

1. Bonjoch, n. P., & Tamayo, p. R. (2001). Proteingehalt Quantifizierung nach Bradford -Methode. In Handbook of Plant Ecophysiology -Techniken (pp. 283-295). Springer, Dordrecht.
2. Bradford, m. M. (1976). Eine schnelle und empfindliche Methode zur Quantifizierung von Mikrogramm-Proteinmengen unter Verwendung der Hauptprotein-Tag-Bindung. Analytische Biochemie, 72 (1-2), 248-254.
3. Kielkopf, c. L., Bauer, w., & Urbatsch, ich. L. (2020). Bradford -Assay zur Bestimmung der Proteinkonzentration. Cold Spring Harbor Protocols, 2020 (4), PDB-Prot102269.
4. Sapan, c. V., Lundblad, r. L., & Preis, n. C. (1999). Kolorimetrische Protein -Assay -Techniken. Biotechnologie und angewandte Biochemie, 29 (2), 99-108.
5. Walker, J. M. (Ed.). (neunzehn sechsundneunzig). Das Proteinprotokolle Handbuch (vol. neunzehn sechsundneunzig). Springer Science & Business Media.