Grammfärbung

Die Grammfärbung ist nützlich, um verschiedene Arten von Bakterien zu visualisieren

Was ist Grams Färbung??

Der Grammfärbung Es ist die einfachste und nützlichste Färbungstechnik in der diagnostischen Mikrobiologie, um Bakterien zu identifizieren. Diese Technik wurde 1884 von dänischem Doktor Christian Gram geschaffen, der Bakterien in gram -positivem (lila) und gramm -negativem (rosa) gemäß der Zusammensetzung der Zellwand klassifizierte.

Die Technik erlitt 1921 bestimmte Modifikationen von Hucker, um Reagenzien zu stabilisieren und die Qualität der Färbung zu verbessern. Daher ist die Färbung von Gram auch als Gram-Hucker bekannt.

Mit dieser Technik ist es auch möglich. Sowie seine Verteilung im Weltraum: in Cluster in Kette, isoliert, paarweise in Tetraden usw.

Basis

Es ist eine Technik, die 4 grundlegende Schritte darstellt. Daher ermöglicht es Ihnen auch, sie zu differenzieren.

Violet Crystal ist der erste verwendete Farbstoff. Gleiches hat eine Affinität zum Peptidoglycan und wird alle vorhandenen Bakterien färben. Anschließend platziert das Lugol, das als unterbrochen wirkt, dh die Bildung von unlöslichen Komplexen von Veilchenglas/Iod-/ribonuklearem Proteinen in der Zelle induziert.

Gram -positive Bakterien mit einer dicken Peptidoglycan -Wand, die komplexer sind (violett/Jodglas). Daher werden sie lila gefärbt.

Es beeinflusst auch, dass die Wand der grampositiven Bakterien mehr unvermeidliche Säuren enthält, die eine große Affinität für Oxidationsmittel aufweisen (Lugol).

Gram -negative Bakterien haben ein dünnes Cape aus Peptidoglycan, was Bakterien weniger komplex bilden als gram -positiv.

Anschließend kommt der Schritt der Verfärbung, bei dem sich gram -positive und gramnegative Bakterien unterschiedlich verhalten.

Gram -negative Bakterien enthalten eine äußere Membran, die reich an Lipopolysacchariden ist, die Teil ihrer Zellwand ist. Fette werden durch Kontakt mit Acetonalkohol zerstört, so.

So wird es später mit dem grundlegenden Safranin oder Fuchsin eingestellt, wobei die rote Farbe nimmt.

Im Fall von grampositiven Bakterien widerstehen sie der Verfärbung, weil das Bleichmittel durch Schließen der Poren wirkt, was verhindert,.

Daher ist die Färbung mit dem violetten Glas stabil und es gibt keinen Platz für Safranin oder Fuchsin. Daher sind diese Bakterien intensiv oder lila gefärbt.

Materialien

Grams Färbemittel besteht aus:

- Violettglas.

- Lugol.

- Acetonalkohol.

- Basis -Safranin oder Fuchsin.

Herstellung von Farbstoffen und Reagenzien

Violett -Kristalllösung

Lösung für:

Violettes Kristall - 2 gr

95% - 20 ccm Ethylalkohol

Lösung B:

Ammoniumoxalat - 0.8 gr

Destilliertes Wasser 80 ccm

Für die endgültige Vorbereitung des violetten Glass muss die Lösung auf 1:10 mit destilliertem Wasser verdünnt werden und mit 4 Teilen Lösung B mischen. Die Mischung wird 24 Stunden lang aufbewahrt, bevor sie sie verwenden. Es wird mit einem Papierfilter in eine bernsteinfarbene Fleckenflasche filtriert.

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Die tägliche Menge wird mit Tropfen in eine Bernsteinflasche verschoben.

Jod-Lugol

Wiegen und messen Sie die angegebene Menge jeder Verbindung wie folgt:

Jodkristalle - 1 g

Kalium ioduro - 2 gr

Destilliertes Wasser - 300 ccm

Das Kaliumiodid wird nach und nach im Wasser gelöst und anschließend wird das Jod zugegeben. Die Lösung für eine Bernsteinflasche wird übertragen.

Die tägliche Menge wird in eine kleinere Bernsteinflasche mit Tropfenbewegung verschoben.

Disconsors

95% Ethylalkohol - 50 ml

Aceton - 50 ml

Es wird in gleichen Teilen vorbereitet. Gut abdecken, weil es dazu neigt, zu verdunsten.

Bottero in Fut.

Diese Vorbereitung bietet eine mäßige Zeitverfärbung 5-10 Sekunden., Und es ist am meisten empfohlen.

Anfänger ziehen es vor, nur 95%Ethylalkohol zu verwenden, wo die Verfärbung langsamer ist, von 10 bis 30 Sekunden lang langsamer.

Während das Erfahrene reine Aceton verwenden kann, wo die Verfärbung sehr schnell von 1 bis 5 Sekunden auftritt.

Kontrast

Safranine Mutterlösung

Safranin - 2.5 gr

95%Ethylalkohol - 100 ccm

Nach dem Gewicht der angegebenen Menge an Safranin löst sie sich bei 100 ccm Ethylalkohol bei 95% auf.

Aus der Mutterlösung wird die Arbeitssafraninlösung vorbereitet.

Dazu messen Sie 10 ccm der Mutterlösung, addieren Sie 90 ccm destilliertes Wasser, um 100 ml zu vervollständigen.

Es wird empfohlen, die tägliche Menge täglich in eine Bernsteinflasche mit Dripper zu übertragen.

Mikroorganismen, die mit Gram-Hucker-Färbung schwach gefärbt sind, wie bestimmte Anaerobes, Legionella SP, Campylobacter sp Und Brucella sp, Sie können viel besser gefärbt werden, wenn die Änderung von Kopeloff zur Färbung von Gram-Hucker, die als Gram-Kopeloff-Färbung bezeichnet wird.

Diese Technik verändert den Safraninfarbstoff für Basic Fuchsin. Mit dieser Modifikation ist es möglich, die oben genannten Mikroorganismen effektiv zu färben.

Aufbewahrung von Reagenzien

Vorbereitete Farbstoffe müssen bei Raumtemperatur gelagert werden.

Vorbereitung der erweiterten Probe auf das Färben

Eine Probe muss mindestens 10 enthalten⁵ Mikroorganismen vor ihrer Beobachtung ist wahrscheinlich in einem Abstrich. Erweiterte können aus der direkten Probe oder den Pflanzen in festen oder flüssigen Medien durchgeführt werden.

Die erweiterten müssen einheitlich, gut verteilt und nicht sehr dick sein, um die vorhandenen Strukturen besser zu visualisieren.

Gramm direkter Proben

Gramm Urin ohne zentrifugieren

Der Urin ist gemischt und 10 µl werden auf einen Objektträger platziert. Die Beobachtung von mindestens einem Bakterium/Immersionsfeld zeigt, dass es eine Infektion gibt.

Dies bedeutet, dass die Ernte ungefähr mehr als 100 hat.000 UFC/ml (10⁵ UFC/ml) Urin in 85% der Fälle.

Diese Methode ist für Kolonialzahlen unter 100 nicht nützlich.000 UFC.

Gramm von CSF

Der CSF sollte zentrifugieren, der Überstand wird entfernt und das Sediment erstreckt sich in einem Objektträger. Diese Flüssigkeit ist unter normalen Bedingungen steril. Bakterienbeobachtung zeigt eine Infektion an.

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Gramm Atemproben

Das Sputum -Gramm, die Bronchial- oder Broncoalveolarwäsche, obwohl es eine Vielzahl von Mikroorganismen gibt, wird es immer die Diagnose leiten, sondern auch die Art der beobachteten Zelle nützlich.

Im Falle von Esputo muss der erweiterte mit den eitglichen Teilen der Probe vorbereitet werden.

Kot Gramm

Es ist nicht ratsam, Gram zu dieser Art von Proben zu machen, da es keinen diagnostischen Wert hat.

Gramm der Ernte

Sie können auf zwei Arten durchgeführt werden, einer von flüssigen Pflanzen und einer von festen Pflanzen.

Flüssigkulturen

Aus flüssigen Kulturen ist es extrem einfach: Unter dem leichteren Braten der trüben Brühe werden auf einen sauberen und trockenen Rutsch gelegt, um kreisförmige Bewegungen von der Mitte bis zur Peripherie zu verleihen, um das Material gleichmäßig zu verteilen.

Es ist spontan in die Luft erlaubt. Nach dem Trocknen wird das Material mit Wärme am Blech festgelegt. Dazu passieren Sie mit Hilfe einer Klemme das Blatt 3 bis 4 Mal durch die Flamme des Bunsen -leichteren und achten Sie darauf, das Material nicht zu verbrennen.

Das Blatt darf abkühlen und auf die Farbbrücke gelegt.

Feste Ernte

Um eine ausgedehnte Grammfärbung aus einer soliden Ernte durchzuführen, gehen Sie wie folgt vor:

Bevor Sie sich für die zu genannten Kolonien entscheiden, müssen Sie das Schlitzlamm vorbereiten und ungefähr zwei Tropfen sterile physiologische Kochsalzlösung platzieren.

Wenn die ursprüngliche Kultivierungsplatte verschiedene Arten verschiedener Kolonien enthält, wird eine isolierte Kolonie von jedem ausgewählt, um das Gramm durchzuführen. Jede Kolonie wird mit dem Platingriff aufgenommen, um sie in der Kochsalzlösung auf dem Objektträger aufzulösen.

Kreisförmige Bewegungen werden von der Mitte zur Peripherie angegeben, um die Kolonie auf der Folie homogen zu verteilen.

Es ist spontan in die Luft erlaubt. Einmal trocken ist das Blatt mit Wärme fixiert, wie oben erläutert (flammen Sie den Schlitzschlitz mit dem Helleren.

Dieses Verfahren muss mit jeder verschiedenen Art von Kolonie durchgeführt werden. Die Reihenfolge dessen, was beispielsweise beobachtet wird:

Colonia 1: Betahemolytic Yellow Colonia: Gramm -positive Kokosnüsse wurden in Clustern beobachtet.

Colonia 2: Creme Colonia ohne Hämolyse: Es wurden gramnegative Cocobacilli beobachtet.

Jedes Blatt muss gekennzeichnet sein, um zu wissen, was wir beobachten.

Technik

Die Färbungstechnik von Gram ist äußerst einfach und relativ wirtschaftlich und kann in einem mikrobiologischen Labor nicht fehlen.

Es geschieht wie folgt:

1. Stellen Sie den Abstrich mit Hitze ein und legen Sie sie auf die Farbbrücke.
2. Das Blatt ist bis 1 Minute vollständig mit violettem Glas bedeckt.
3. Mit Wasser waschen. Nicht trocknen.
4. Decken Sie das Blatt mit Lugol -Lösung ab und lassen Sie es 1 Minute lang handeln. Mit Wasser waschen. Nicht trocknen.
5. Dekorieren Sie 5-10 Sekunden mit weicher Aufregung in Acetonalkohol. O Legen Sie das Blatt vertikal und lassen Sie Tropfen Tropfen auf die Oberfläche ab, bis es den Ersatz von violettem Kristall schlepp. Nicht überschreiten.
6. Mit Wasser waschen. Nicht trocknen.
7. Legen Sie das Blatt auf der Färbungbrücke und bedecken Sie sie 30 Sekunden lang mit Safranin (Gram-Hucker) oder 1 min mit Basic Fuchsina (Gram-Kopeloff).
8. Mit Wasser waschen.
9. Spontan in vertikaler Position in der Luft ausgelassen.

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Sobald Sie trocknen, stellen Sie 1 Tropfen Immersionöl, um es unter dem Ziel von 100x im optischen Mikroskop zu beobachten.

Verwendet/Anwendungen der Grammfärbung

- Diese Technik ermöglicht die Unterscheidung der Morphotintorialunterschiede der meisten Bakterien.

- Hefen werden auch durch diese Färbung unterschieden. Sie nehmen das violettes Glas, das heißt, sie sind grampositiv gefärbt.

- Sie können grampositive Sporen Bacilli unterscheiden, wo ein klarer Raum innerhalb des Bacillus beobachtet wird, in dem sich die Endospora gebildet hat, obwohl die Sporen nicht gut gefärbt sind. Um Sporen zu färben, werden andere Techniken verwendet, wie z. B. Shaeffer-Fulton.

- Hilft, die Art des Antibiotikums zu bestimmen, der vorbereitet werden muss.

Es ist zu beachten, dass diese Färbung Es funktioniert nicht Alle Arten von Bakterien zu färben, dh es gibt Fälle, in denen die Färbung nicht funktioniert.

In diesen Fällen kann Bakterien, denen die Zellwand fehlt, erwähnt werden. Zum Beispiel: Geschlecht Mycoplasma, Sphäroplast, Harnstoff, L Formen und Protoplasten.

Darüber hinaus Bakterien mit Bakterien, die reich an Mykolsäuren wie Mykobakterien und intrazellulären Bakterien wie Chlamydias und Rickettsias sind.

Es ist auch unwirksam, die meisten Spirochemalbakterien zu färben.

Es gibt Bakterien derselben Gattung, die in derselben Probe wie grampositiv und als gram -negativ beobachtet werden können. In diesem Fall wird es als variable Grammfärbung bezeichnet, was auf eine Veränderung der Nährstoffe, der Temperatur, des pH -Werts oder der Elektrolytkonzentration zurückzuführen ist.

Häufige Fehler

Übertrieben dekorieren

Übertreiben im Verfärbungs -Pass kann die Beobachtung falscher gram -negativer Mikroorganismen verursachen.

Warten Sie nicht auf genügend Trocknungszeit, um das Immersionöl hinzuzufügen

Dieser Fehler führt dazu, dass Fettmischungen bilden, die die Beobachtung der vorhanden. Dies geschieht, wenn das Öl die im Geruch vorhandenen Wassermoleküle verbindet.

Investieren Sie die Reihenfolge der Reagenzien

Ein solcher Fehler erzeugt gramnegative Bakterien, die sichtbar machen, dh false gram -positiv.

Verwenden Sie alte Pflanzen (Feststoffe oder Flüssigkeiten)

Es kann zu grampositiven Bakterien führen, um gram -negative zu färben (gram -negatives Falsch). Dies geschieht, weil es bei alten Pflanzen wahrscheinlich tote oder verschlechterte Bakterien gibt, und unter diesen Bedingungen behalten die Bakterien das Violettglas nicht bei.

Verwenden Sie eine sehr alte Lugol -Lösung

Im Laufe der Zeit verliert Lugol seine Eigenschaften und seine Farbe verblasst. Wenn das bereits degenerierte Reagenz verwendet wird.

Blauer Hintergrund

Ein richtig verfärbter Hintergrund ist rot. Ein blauer Hintergrund zeigt an, dass die Verfärbung unzureichend war.

Verweise

1. Häuser-Rincón, g. (1994). Allgemeine Mykologie. Zentrale Universität von Venezuela.
2. Grammfärbung. Davon genommen.Wikipedia.Org.
3. González, m., González, n. (2011). Handbuch für medizinische Mikrobiologie. Direktion der Medien- und Veröffentlichungen der Universität Carabobo.